среда, 31 октября 2018 г.

Если бы у микробов были глаза, видели ли бы они друг друга?

Рисунок © Н.В.
Нет, микробы не смогли бы видеть своих собратьев. Дело в том, что из-за физических свойств света такой оптический прибор, как глаз, имеет минимальный допустимый размер, и этот минимальный размер больше крупного микроба. К тому же, глаз не так просто построить — это орган, требующий многих живых клеток, а у микроба их всего одна — это он сам: ведь микробы обычно одноклеточные.
Но, скажете вы, пусть всё же у микробов появились волшебным образом невозможные микроглаза. Что тогда?
Но и тогда микробы не смогут увидеть других микробов. Потому что для того, чтобыувидеть, мало одних только глаз. Глаз воспринимает свет, а зрение — то чувство, которое «видит», — плод более сложной деятельности нервной системы. Зрение может обеспечиваться незамысловатой нервной системой, как у пчелы, а может — необыкновенно мудреной и разветвленной, как у кошки. Но у микроба, простейшего существа, нет совсем никакой нервной системы, поэтому глаза, даже если бы их и удалось разместить на поверхности микроба, просто было бы не к чему подключить.
А если бы микробы оснастились вдруг и нервной системой, то это стали бы уже не микробы.
Ответил: Александр Венедюхин elementy.ru

вторник, 30 октября 2018 г.


Зафиксирована смерть ближайшей к нам галактики



Малое Магелланово Облако

Астрономы Австралийского национального университета зафиксировали мощный отток водорода из Малого Магелланова Облака (ММО) — карликовой галактики, которая является спутником Млечного Пути наряду с Большим Магеллановым Облаком (БМО). Потеря межзвездного вещества способствует прекращению звездообразования. Об этом сообщает Science Alert.
Облака, космокрылые лошадки..
ММО находится в 200 тыс. световых лет от Земли, а по диаметру оно в 10 раз меньше Млечного Пути. Облако гравитационно связано с БМО и соединено с ним газовым «мостом». Карликовая галактика имеет большое количество рентгеновских двойных и массивных звезд.


Радиоинтерферометр ASKAP

Исследователи провели наблюдения за ММО с помощью австралийского радиоинтерферометра ASKAP. Они оценили объемы уходящего из галактики атомарного водорода — основного компонента, необходимого для звездообразования. Отток холодного газа происходит из центральной перемычки, где новые звезды еще появляются. Он простирается на 6523 световых года и сформировался, по оценкам, 25-60 миллионов лет назад. Масса уходящего газа составляет 10 миллионов масс Солнца
Причина смерти


Соседи Млечного пути

Звездные ветра и вспышки сверхновых «сдувают» газ из галактики. Этот процесс называется звездной обратной связью. При этом количество газа на порядок превышает скорость образования звезд. Хоть процесс в конечном итоге уничтожит ММО, он питает Магелланов Поток — цепочку облаков газа, протянувшихся до Южного полюса Млечного Пути.
По материалам: https://lenta.ru

Земля потеряла 60% всех животных за 40 лет


Над Минском заметили лунное гало


пятница, 26 октября 2018 г.

Где находится центр Вселенной? То есть по теории Большого взрыва вселенная начала расширяться. А где находится точка или координаты места начала этого взрыва?

Где находится центр Вселенной? Рисунок © Е.В.
Вопросы о центре Вселенной возникают довольно часто, и причина — в словосочетании «Большой взрыв», которое является переводом английского термина «Big Bang» — Большой бум. Этот термин был придуман известным физикомФредом Хойлом, который таким образом выразил свое саркастическое отношение к идее возникновения Вселенной. Космологи сарказма не уловили и охотно взяли термин на вооружение. Английское словосочетание Big Bang, конечно, не является строгим физическим термином, но оно на такой термин и не похоже! Русский перевод — Большой взрыв — выглядит более солидно и потому кажется более физичным, что многих вводит в заблуждение. Раз был взрыв, значит, было и место взрыва, и то, что взорвалось... На самом деле у расширения Вселенной центра быть не должно. Здесь самая популярная аналогия — надуваемый воздушный шарик. Его поверхность расширяется, но никакого центра у этого расширения нет.
Ответил: Дмитрий Вибе elementy.ru

Новый метод MicroED определяет молекулярную структуру вещества за полчаса

Рис. 1. Определение структуры молекулы прогестерона с помощью нового метода электронной дифракции
Рис. 1. Определение структуры молекулы прогестерона с помощью нового метода электронной дифракции. Порошок из банки с прогестероном высыпают на салфетку, слегка измельчают, наносят крупинки на специальную сетку для помещения в электронный микроскоп, в микроскопе образец замораживается до температуры жидкого азота, крупицу (нанокристалл) облучают пучком электронов, в течении трех минут собирают данные дифракции электронов на специальную КМОП-матрицу, анализируют их компьютерной программой, и через десять минут программа выдает рисунок структуры с разрешением менее одного ангстрема (1Å). Синей сеткой вокруг атомов обозначена амплитуда их вибрации. Весь процесс от открытия банки до получения структуры занимает менее получаса. Рисунок из обсуждаемой статьи
Достоверное определение молекулярной структуры вещества (особенно новых веществ) — это почти всегда длительный процесс, включающий в себя очистку, приготовление образцов и использование нескольких независимых аналитических и физических методов анализа. Он может занимать дни, недели или месяцы. Но похоже, мы находимся на пороге революции в этой области: исследователи из США выложили в открытый доступ препринт статьи с описанием нового прямого метода определения структуры органических молекул в твердом виде при помощи электронной дифракции, который выдает результат буквально за полчаса. Такой прорыв стал возможен благодаря облучению образца пучком электронов с разных сторон и специально разработанному алгоритму анализа получающейся дифракционной картины.
С самого начала истории химии определение структуры веществ было одной из самых важных и при этом самых сложных задач. Практически все химические исследования или рутинные проверки включают в себя определение структуры вещества. В художественных фильмах, отнюдь не только фантастических, очень часто можно видеть, как химик кладет только что найденный образец в прибор — и у него на экране сразу появляется структура доселе неизвестной молекулы. У настоящих химиков такие кадры могут вызвать лишь ухмылку. Кое-какие методы мгновенного определения структуры есть и используются, например, в аэропортах для поиска наркотиков и взрывчатых веществ. Но все эти методы нацелены на очень ограниченное количество молекул, все без исключения являются косвенными и структуру чего-либо нового, не заложенного в них, распознать не способны.
Создано и множество лабораторных методов, которые применяются, когда скорость не очень важна, зато нужно как можно точнее выявить структуру молекулы. Это определение точек кипения и плавления, измерение спектров поглощения и отражения волн различных длин (см. Ультрафиолетовая спектроскопия иИнфракрасная спектроскопия), элементный и спектральный анализы (определение продуктов горения и их спектров) и многие другие. В наши дни наиболее популярными являются ЯМР-спектроскопиямасс-спектрометрия ирентгенокристаллография. Первые два метода — косвенные: с их помощью структура определяется не напрямую, а через сигналы взаимодействия магнитных ядер с магнитным полем (в случае ЯМР-спектроскопии) и через определение молярных масс ионизированных продуктов распада (в случае масс-спектрометрии). Из-за косвенности определить структуру не всегда получается, и возможны ошибки. На данный момент нет компьютерной программы, которая, проанализировав полученные этими методами спектры, сможет определить структуру нового вещества. Поэтому золотым стандартом считается третий метод — рентгенокристаллография.
Этот метод основан на измерении дифракции рентгеновских лучей, отраженных от кристалла вещества: из полученной дифракционной картины высчитывается молекулярная структура с разрешением до отдельных атомов, если они больше водорода (атомы водорода видны не всегда, и их расположение часто экстраполируют). Структуры, определенные этим методом с достаточно хорошим разрешением, сомнению почти никогда не подвергаются, и всё бы хорошо, но далеко не любое вещество можно кристаллизовать. И даже когда кристаллизовать получается, кристалл должен быть высокого качества (с небольшим количеством дефектов) и видимого размера (желательно — миллиметрового). На получение таких кристаллов могут уходить недели, процесс сложно воспроизводим и во многом зависит от случая. Тем не менее многие журналы и рецензенты отказываются принимать публикации о новых веществах без рентгеноструктуры. Да и сами химики без этого анализа часто не могут быть уверены в своем открытии и даже в правильности анализа известных веществ.
Поэтому несложно представить возбуждение, охватившее химиков во всем мире, когда неделю назад в открытый доступ на сайте препринтов химических статей chemrxiv.org была выложена статья с описанием прямого метода определения структуры молекул, который требует всего нескольких десятков минут, подходит почти для любых твердых веществ и для которого хватает наноразмерного образца (рис. 1). Вещество всё равно должно быть в кристаллической форме, но размер может быть настолько крохотным, что получить кристаллы достаточного качества (без дефектов) не представляет трудности. Настолько мелкие кристаллы зачастую образуются спонтанно при высушивании раствора — проблему для применения в рентгенокристаллографии представляет их многократное укрупнение без образования дефектов. Метод, названный авторами MicroED (аббревиатура от micro-electron diffraction — «микроскопия + электронная дифракция»), является адаптацией и улучшением технологии электронной кристаллографии в криоэлектроннoй микроскопии, которая использовалась до сих пор для определения структуры белков, и за которую была вручена Нобелевская премия по химии в 2017 году.
Так как взаимодействие электронов с веществом намного сильнее, чем у рентгеновских фотонов, для получения высокого разрешения требуется значительно меньшее количество сканирований и, соответственно, кристалл намного меньшего размера. Однако, для небольших молекул эта технология раньше была неприменима из-за быстрого разрушения образцов высокоэнергетичным пучком электронов. Авторы новой методики решили эту проблему снижением интенсивности пучка в 200 раз (по сравнению с использовавшимися ранее методами электронной дифракции) и сканированием крупицы вещества под множеством разных углов (образец вращается со скоростью 0,5 градуса в секунду). Сыграли роль также появление суперчувствительных матриц и разработка компьютерной программы, обрабатывающей полученные данные, — структура молекулы, разумеется, высчитывается математическими алгоритмами (так же, как в рентгенокристаллографии).
Первоначально эта методика была описана в 2013 году для более качественного определения структуры белков, замороженных в водном растворе (D. Shi et al., 2013.Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals). И вот, спустя пять лет, ученые под руководством Тамира Гонена (Tamir Gonen), который занимался разработкой MicroED, при содействии группы Брайена Штольца (Brian M. Stoltz) адаптировали эту технологию для почти любых нанокристаллов небольших нерастворенных молекул.
Помимо прогестерона авторы обсуждаемой статьи определили структуры десятков известных веществ: лекарственных препаратов, витаминов и натуральных продуктов. Среди них были и довольно крупные молекулы, как, например, тиострептон (thiostrepton, рис. 2). Большие молекулы (как белки) должны быть заморожены в водной матрице, чтобы уменьшить спонтанное движение групп, ухудшающее разрешение. Кристаллы небольших молекул и так достаточно плотные, поэтому заморозка в матрице не требуется. Но чем молекула больше, тем хуже разрешение нового метода.
Рис. 2. Структура молекулы тиострептона, полученная методом MicroED
Рис. 2. Структура молекулы тиострептона, полученная методом MicroED. Атомы углерода показаны синим, кислорода — красным, азота — желтым. Атомы водорода не показаны, чтобы не усложнять картину. Рисунок из обсуждаемой статьи в chemrxiv.org
Hа вид аморфные (без заметных невооруженным глазом кристаллов) порошки были проанализированы прямо в том виде, в каком они были получены от поставщиков, без какой-либо дополнительной обработки — их даже не всегда надо было измельчать. Объемы нанокристаллов вещества были в миллиарды раз меньше необходимого для рентгенокристаллографии. Авторы продемонстрировали дополнительное преимущество MicroED: блaгодаря сильному взаимодействию электронов с веществом он часто напрямую определяет расположение атомов водорода в анализируемой молекуле (гораздо чаще, чем это происходит при рентгенокристаллографии).
Вещества «из коробки», возможно, проходят через кристаллизацию — это может быть частью процедур очистки перед продажей. Поэтому для лучшей демонстрации потенциала метода авторы решили проверить его на веществах, которые не были намеренно кристаллизованы, а были только что очищены жидкостной хроматографией в их лаборатории. С такими веществами структура была успешно расшифрована без какой-либо обработки в двух из четырех проверенных случаев (молекулы (-)-лимаспермидина и оксиндола).
Рис. 3 демонстрирует еще одну уникальную возможность, которую предоставляет метод MicroED. Несколько веществ (биотин, цинхонин, карбамазепин и бруцин) смешали, смесь поместили под микроскоп и в течении нескольких минут, учитывая уже полученные данные на индивидуальных образцах, смогли определить, к какому из четырех веществ относится каждый отдельный нанокристалл.
Рис. 3. MicroED-анализ смеси смеси кристалликов биотина, цинхонина, карбамазепина и бруцина позволил определить, где какое вещество, за считаные минуты
Рис. 3. MicroED-анализ смеси смеси кристалликов биотина, цинхонина, карбамазепина и бруцина позволил определить, где какое вещество, за считаные минуты. Метод рентгенокристаллографии на такое и близко не способен. Рисунок из обсуждаемой статьи в chemrxiv.org
Авторы надеются, что метод вскоре станет стандартным для анализа и определения структуры веществ в любой химической лаборатории. Возможно, скоро сцены химического анализа из плохих (с точки зрения отражения «химических» реалий) фильмов станут реальностью.
* * *
В тот же день была опубликована работа европейской конкурирующей группы исследователей из Германии и Швейцарии с очень похожим методом, который авторы пока никак не назвали. Как и их американские коллеги, они используют чувствительный детектор, но механизма, постепенно вращающего кристаллы, у них нет, и они их не замораживают. Вместо этого они выбирали более крупные кристаллы (микро- вместо наноразмерных) и сканировaли тонким пучком электронов разные регионы, чтобы собрать достаточное для анализа число сканирований. Такие кристаллы, хоть и более крупные, всё еще гораздо меньше, чем требуются для рентгенокристаллографии в лабораторных условиях.
Своим методом исследователи проанализировали всего две молекулы. Первая — это молекула парацетамола. Чтобы получить ее структуру авторы просто раскрыли капсулу с порошком (pис. 4a), который в основном состоит не из парацетамола, а из различных некристалличных (аморфных) наполнителей.
Рис. 4. Определение структуры молекулы парацетамола из капсулы
Рис. 4. Определение структуры молекулы парацетамола из капсулы. a — открытая капсула; b — кристалл парацетамола увиденный в микроскопе; c — дифракция электронов отражённых от кристалла; d — полученная структура парацетамола; атомы кислорода красные, азота — синие, углерода — черные, водорода — белые в синих кружочках. Рисунок из статьи в Angewandte Chemie
С помощью микркоскопа увидеть микрокристалл (pис. 4b) не составило труда, и через 10 минут электронной дифракцией (pис. 4c) была получена структура парацетамола с водородами и высоким разрешением (pис. 4d). Вторая молекула — метиленовый синий — важный индустриальный краситель используемый также в фармацевтике, из которого трудно получить большие кристаллы, пригодные для рентгенокристаллографии.
* * *
Источник: Christopher G. Jones, Michael W. Martynowycz, Johan Hattne, Tyler Fulton, Brian M. Stoltz, Jose A. Rodriguez, Hosea M. Nelson, Tamir Gonen. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure — препринт на сайте chemrxiv.org.
См. также:
Robert F. Service. ‘A new day for chemistry’: Molecular CT scan could dramatically speed drug discovery — колонка, посвященная обсуждаемой статье на сайте журналаScience.
Григорий Молев element.ru

среда, 24 октября 2018 г.


Гавайский остров неожиданно ушел под воду


Почему у человека некоторые органы — парные (например, легкие, почки), а другие — в одном экземпляре?

Иллюстрация, показывающая различные типы симметрий, существующие на Земле. Демонстрируется в Музее естественной истории имени Филда в Чикаго, США
Иллюстрация, показывающая различные типы симметрий, существующие на Земле. Демонстрируется в Музее естественной истории имени Филда в Чикаго, США. Здесь показаны и те виды симметрии, которые не были описаны в этой статье, поскольку не встречаются у человека (например, спиральная симметрия раковин моллюсков). Изображение с сайта en.wikipedia.org
Вначале попробуем ответить на вспомогательный вопрос: почему у человека некоторые части тела симметричны, а другие — нет?
Симметрия — базовое свойство большинства живых существ. Быть симметричным очень удобно. Подумайте сами: если у вас со всех сторон есть глаза, уши, носы, рты и конечности, то вы успеете вовремя почувствовать что-то подозрительное, с какой бы стороны оно ни подкрадывалось, и, в зависимости от того, какое оно, это подозрительное, — съесть его или, наоборот, от него удрать.
Самая безупречная, «самая симметричная» из всех симметрий — сферическая, когда у тела не отличаются верхняя, нижняя, правая, левая, передняя и задняя части, и оно совпадает само с собой при повороте вокруг центра симметрии на любой угол. Однако это возможно только в такой среде, которая сама идеально симметрична во всех направлениях и в которой со всех сторон на тело действуют одни и те же силы. Но на нашей земле подобной среды нет. Существует по крайней мере одна сила — сила тяжести, — которая действует только по одной оси (верх-низ) и не влияет на остальные (вперед-назад, вправо-влево). Она всё тянет вниз. И живым существам приходится к этому приспосабливаться.
Так возникает следующий тип симметрии — радиальная. У радиально-симметричных существ есть верхняя и нижняя части, но правой и левой, передней и задней нет. Они совпадают сами с собой при вращении только вокруг одной оси. К ним относятся, например, морские звезды и гидры. Эти создания малоподвижны и занимаются «тихой охотой» за проплывающей мимо живностью.
Актинии (морские анемоны) — пример радиально симметричных организмов. Рисунок из книги Эрнста Геккеля «Красота форм в природе»
Актинии (морские анемоны) — пример радиально симметричных организмов. Рисунок из книги Эрнста Геккеля «Красота форм в природе». Изображение с сайта en.wikipedia.org
Но если какое-то существо собирается вести активный образ жизни, гоняясь за жертвами и удирая от хищников, для него приобретает важность еще одно направление — передне-заднее. Та часть тела, которая находится впереди, когда животное двигается, становится более значимой. Сюда «переползают» все органы чувств, а заодно и нервные узлы, которые анализируют полученную от органов чувств информацию (у некоторых счастливчиков эти узлы потом превратятся в головной мозг). К тому же, спереди должен находиться рот, чтобы успеть ухватить настигнутую добычу. Всё это обычно располагается на отдельном участке тела — голове (у радиально-симметричных животных головы нет в принципе). Так возникаетбилатеральная (или двусторонняя) симметрия. У билатерально-симметричного существа отличаются верхняя и нижняя, передняя и задняя части, и только правая и левая идентичны и являются зеркальным отображением друг друга. Этот тип симметрии характерен для большинства животных, включая и человека.
«Витрувианский человек» Леонардо да Винчи показывает пример билатеральной симметрии
«Витрувианский человек» Леонардо да Винчи показывает пример билатеральной симметрии. Изображение с сайта en.wikipedia.org
У некоторых животных, например у кольчатых червей, помимо билатеральной есть и еще одна симметрия — метамерная. Их тело (за исключением самой передней части) состоит из одинаковых члеников-метамеров, и если сдвигаться вдоль тела, червь сам с собой «совпадает». У более развитых животных, включая человека, сохраняется слабое «эхо» такой симметрии: в каком-то смысле, наши позвонки и рёбра тоже можно назвать метамерами.
Человеческие ребра имеют некоторые черты метамерной симметрии
Человеческие ребра имеют некоторые черты метамерной симметрии. First thoracic — первый грудной позвонок, first lumbar — первый поясничный. Изображение с сайта ru.wikipedia.org
Итак, почему у человека есть парные органы, мы разобрались. Теперь обсудим, откуда взялись непарные.
Для начала попробуем понять: что же является осью симметрии для самых простых, радиально симметричных, примитивных многоклеточных? Ответ простой: это пищеварительная система. Вокруг нее и выстраивается весь организм, и организован он так, чтобы каждая клеточка тела находилась близко к «кормушке» и получала достаточное количество питательных веществ. Представим себе гидру: ее рот симметрично окружен щупальцами, которые загоняют туда добычу, а кишечная полость находится в самой середине организма и является осью, вокруг которой формируется всё остальное тело. Пищеварительная система у таких существ одна по определению, потому что «под нее» и выстраивается весь организм.
Постепенно животные усложнялись, и их пищеварительная система тоже становилась всё более совершенной. Кишечник удлинился, чтобы более эффективно переваривать пищу, и поэтому ему пришлось сложиться в несколько раз, чтобы поместиться в брюшной полости. Появились дополнительные органы — печень, желчный пузырь, поджелудочная железа, — которые расположились в организме асимметрично и «подвинули» некоторые другие органы (например, из-за того, что печень расположена справа, правая почка и правый яичник/яичко сдвинуты вниз относительно левого). У человека изо всей пищеварительной системы только рот, глотка, пищевод и анальное отверстие сохранили свое положение на плоскости симметрии организма. Но пищеварительная система и все ее органы так и остались у нас в единственном экземпляре.
Теперь посмотрим на кровеносную систему.
Если животное маленькое, у него нет проблемы с тем, чтобы питательные вещества дошли до каждой клеточки, — ведь все клетки находятся достаточно близко к пищеварительной системе. Но чем больше живое существо, тем острее для него возникает проблема доставки питания до «отдаленных провинций», находящихся на большом расстоянии от кишечника, на периферии тела. Появляется потребность в чём-то, что «кормило» бы эти участки, а кроме этого, соединяло всё тело воедино и позволяло далеко расположенным регионам «общаться» между собой (а у некоторых животных также разносило бы кислород от органов дыхания по всему телу). Так появляется кровеносная система.
Кровеносная система выстраивается вдоль пищеварительной, и поэтому состоит она, в самых примитивных случаях, всего лишь из двух главных сосудов — брюшного и спинного — и нескольких соединяющих их дополнительных. Если существо маленькое и слабоподвижное (как, например, ланцетник), то для того, чтобы кровь двигалась по сосудам, достаточно сокращения самих этих сосудов. Но относительно крупным существам, ведущим более активный образ жизни (например, рыбам), этого мало. Поэтому у них часть брюшного сосуда превращается в специальный мышечный орган, с силой толкающий кровь вперед, — сердце. Поскольку оно возникло на непарном сосуде, то и само оно «одинокое» и непарное. У рыб сердце симметрично само по себе и в теле располагается на плоскости симметрии. Но у наземных животных, в связи с появлением второго круга кровообращения, левая часть сердечной мышцы становится больше правой, и сердце сдвигается в левую сторону, теряя и симметричность своего положения, и свою собственную симметрию.
Ответила: Вера Башмакова elementy.ru

Нобелевская премия по химии — 2018


Лауреаты нобелевской премии по химии 2018 года
Рис. 1. Лауреаты нобелевской премии по химии 2018 года. Слева направо: Фрэнсис Арнольд (Frances H. Arnold), Джордж Смит (George P. Smith) и Грег Уинтер (Sir Gregory P. Winter). Фото с сайта sciencenews.org
Нобелевскую премию по химии в 2018 году разделили между собой трое ученых: половина премии досталась американской исследовательнице Фрэнсис Арнольд «за направленную эволюцию ферментов», вторую половину поровну поделили американец Джордж Смит и Грег Уинтер из Великобритании — «за фаговый дисплей пептидов и антител». Исследования, которые удостоились премии, имеют ярко выраженный прикладной характер, а объединяет их то, что все авторы связаны с разработкой методов для получения полезных для человека белков и пептидов, основанных на имитации естественного «метода» биологической эволюции, а именно — на сочетании случайной изменчивости и неслучайного отбора. Все лауреаты имеют за плечами долгий путь исследовательской работы и множество престижных наград и премий.
Белки (также называемые полипептидами) — это наиважнейший класс биополимеров. Каждый полипептид представляет собой цепочку из соединенных одна за другой аминокислот, количество которых может быть очень разным, от нескольких штук до нескольких сотен, а иногда их может быть даже больше тысячи. Короткие цепочки (менее сотни аминокислот) обычно называют не белками, а пептидами: разница здесь скорее количественная, чем качественная. В природе белки строятся в основном из двадцати разновидностей аминокислот. Полипептидные цепочки далее сворачиваются определенным образом, приобретая разнообразные пространственные конфигурации, превращаясь во что-то вроде деталек конструктора LEGO (рис. 2).
Рис. 2. Примеры белковых молекул; показаны модели их трехмерной конфигурации
Рис. 2. Примеры белковых молекул; показаны модели их трехмерной конфигурации. Рисунок из статьи L. L. Porter, G. D. Rose, 2012. A thermodynamic definition of protein domains
Важность белков для живой природы невозможно переоценить. Во-первых, белки — это строительные блоки, из которых выстроены и сами живые клетки, и остов межклеточного вещества, к которому клетки прикрепляются. Можно наглядно убедиться, что если взять, к примеру, сердце и удалить из него все клетки (эта процедура называется децеллюляризацией), то белковый остов, который при этом останется, полностью сохранит форму полноценного органа (см. картинку дня«Децеллюляризованное сердце»).
Во-вторых, значительная часть белков — ферменты, то есть они являются биологическими катализаторами, которые имеют ряд важных отличительных свойств и преимуществ по сравнению с обычными химическими катализаторами небелковой природы. А именно — необычайно высокую эффективность, специфичность к конкретному типу субстрата и регулируемость: фермент под воздействием определенных внешних факторов или посредством взаимодействия с ним другого белка может переходить из активной формы в неактивную, и наоборот.
В-третьих, некоторые белки — антитела — служат в качестве нанооружия против вражеских агентов (бактерий, вирусов или токсинов), попадающих в организм из внешней среды, выполняя, таким образом, защитную функцию. Это обеспечивается благодаря способности антител прочно связываться с самыми разными молекулами-антигенами.
А еще есть белки-рецепторы, позволяющие живым клеткам воспринимать сигналы (химические или физические) из внешней среды, а также белки-регуляторы, которые управляют реакциями клеток на полученные сигналы, в частности, осуществляя активацию или инактивацию определенных ферментов (белкам-рецепторам и регуляторам посвящена другая нобелевская премия этого года — по физиологии и медицине, см. новость Нобелевская премия по физиологии и медицине — 2018, «Элементы», 04.10.2018).
Нет ничего удивительного в том, что люди видят перспективы в приручении этих замечательных молекул для решения широкого круга задач, выходящих за рамки сугубо естественных процессов. Мы хотели бы создавать новые виды катализаторов, не изобретенных самой природой, а также белки и пептиды, которые бы эффективно связывали любой вид молекул, который нас интересует.
Чтобы получать новые белки с заданными свойствами, их, по идее, нужно сначала изобрести. Свойства белков зависят от пространственной конформации белковой молекулы, а также от распределения в молекуле электрических зарядов. Эти характеристики, в свою очередь, определяются свойствами аминокислот, из которых построен белок. Причем важно не только, какие аминокислоты и в каком количестве входят в цепочку, но и в каком порядке они расположены. Теоретически, зная свойства аминокислот и строение полипептидной цепочки, можно было бы предсказывать конфигурацию и химические свойства конечного белка. А раз так, то почему бы не изобретать белки под свои цели точно так же, как инженеры изобретают всевозможные технические устройства — от шариковых ручек до компьютеров? Увы, не все так просто. Дело в том, что зачастую для одной и той же цепочки аминокислот существует несколько возможных устойчивых конфигураций, а кроме того, в момент взаимодействия с другими молекулами в реакционной смеси конфигурация может меняться из-за перераспределения зарядов в молекуле. Все это крайне затрудняет возможности «рационального дизайна» новых необходимых белков и пептидов.
Выход из этого затруднения есть, и он изобретен миллиарды лет назад самой природой — это метод проб и ошибок: генерирование случайного разнообразия с последующим отбором продуктов, обладающих нужными свойствами. Это и есть, по сути, «метод» природной эволюции белков, и именно за приручение принципа дарвиновской эволюции в целях лабораторной белковой инженерии и была вручена в этом году нобелевская премия по химии.
Премия разделена на две части неспроста — подходы, которые использовалаФрэнсис Арнольд (Frances H. Arnold) для «направленной эволюции ферментов» существенно отличаются от подхода «фагового дисплея», разработанного Джорджем Смитом (George P. Smith) и адаптированного Грегом Уинтером (Sir Gregory P. Winter) для получения специфичных пептидов и антител. Поэтому мы тоже рассмотрим эти две части по отдельности.
Доска с поздравлениями Фрэнсис Арнольд от коллег на факультете химии и химической технологии Калифорнийского технологического института
Рис. 3. Плакат рядом с лабораторией Фрэнсис Арнольд в Калифорнийском технологическом институте. Фото © Н.В.
Фрэнсис Арнольд получила свой первый «неестественный» (non-natural) фермент в 1993 году (K. Chen, F. H. Arnold, 1993. Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide). Тогда был получен новый вариант фермента субтилизина Е, который катализирует расщепление и образование пептидных связей (соединений между аминокислотами в пептидных цепочках), причем, благодаря методу направленной эволюции и внесению в исходно взятый природный белок 10 аминокислотных замен, удалось заставить фермент работать в органическом растворителе (60% диметилформамиде) и повысить термостабильность на 18 градусов. По техническим причинам достаточно часто возникает необходимость проводить некоторые реакции химического синтеза в органических растворителях при повышенных температурах, так что этот результат имеет большое значение для практической химии.
Работа прошла через следующие этапы: сначала был найден подходящий природный ген. Выбор гена, с которого следует начать, — вопрос не всегда простой. По словам самой Фрэнсис Арнольд, иногда это вопрос интуиции. Но общий принцип состоит в том, чтобы, по возможности, постараться найти белок, который проявляет способность катализировать нужную реакцию хотя бы в очень слабой степени. Выбранный ген встроили в плазмиду (кольцевую молекулу ДНК), чтобы его можно было размножать в бактериях — кишечных палочках — это достаточно стандартная процедура в генной инженерии (см. подробный рассказ об этом). Далее, при помощиполимеразной цепной реакции (ПЦР) в этот ген ввели четыре заранее спроектированных замены. На этом этапе ученые руководствовались расчетами, основанными на компьютерном моделировании. Эти замены должны были изменить в желаемом направлении форму активного центра фермента и обеспечить более эффективную его работу в требуемых условиях. Нужные замены ввели при помощи праймеров, содержащих замещенные нуклеотиды. Дальше дело за бактериями — в процессе роста и деления они размножают плазмиду и одновременно синтезируют белок, закодированный в этой плазмиде. После этого белок выделяют и тестируют на уровень ферментативной активности.
Активность оставалась все еще слишком низкой. Чтобы улучшить результат, на следующем этапе ген провели через три раунда «мутагенной ПЦР». В такой ПЦР мутации вводятся случайным образом благодаря специально подобранным условиям — таким, в которых фермент ДНК-полимераза совершает «ошибки» чаще обычного. После каждого раунда вводили гены в бактерий, выделяли фермент и проводили скрининг (массовую проверку) с целью поиска самого эффективно работающего варианта. В итоге в белке появилось еще шесть дополнительных замен, и, вуаля! — получен необходимый высоко эффективный фермент.
В дальнейшем Фрэнсис Арнольд, а также другие исследователи, взявшие на вооружение предложенный ею метод, получили еще множество полезных ферментов с необычными свойствами. Методика совершенствовалась: к методам генерирования случайных мутаций добавились методы, предусматривающие также случайный обмен участками между мутантными последовательностями. Либо, в качестве альтернативы, используется обмен участками между природными генами, составляющими большое генное семейство — за время эволюционной истории они уже естественным образом накопили множество мутаций, а комбинаторный подход может помочь на этой базе получить ферменты с новыми свойствами.
Так, очень плодотворными оказались работы по получению катализаторов для необычных химических реакций с семейством генов цитохрома P450. На рис. 4 приведен частичный список естественных и «неестественных» реакций, которые катализируются этой группой ферментов.
Рис. 3. Реакции, которые катализируются природными цитохромами P450
Рис. 4. Реакции, которые катализируются природными цитохромами P450 (в левой половине рисунка, на голубом фоне) и новыми ферментами, полученными на их основе методом направленной эволюции: 1 — циклопропанирование, 2 — азидирование, 3 — сульфимидирование, 4 — аминирование C–H связи, 5 — инсерция N–H связи. В центреизображена обобщенная модель трехмерной конфигурации цитохрома P450. Обозначения: R — любой радикал, Ar — ароматический радикал, Ts — тозил. Реакций, показанных на розовом фоне, в природе не существует (или, по крайней мере, пока не обнаружено). Рисунок из статьи F. Arnold, 2015. The nature of chemical innovation: new enzymes by evolution
Общая схема направленной эволюции ферментов, в ее современном виде, показана на рис. 5.
Рис. 4. Схема процессов, используемых в белковой инженерии
Рис. 5. Схема процессов, используемых в белковой инженерии. Метод «случайного поиска», лежащий в основе направленной эволюции белков (слева), может в той или иной степени совмещаться с рациональным дизайном, опирающимся на знания о закономерностях взаимосвязи между строением и функциями белков, используемых в программах для виртуального моделирования. Рисунок из статьи V. Stepankova et al., 2013. Strategies for Stabilization of Enzymes in Organic Solvents
Таким образом, практический выход работы Фрэнсис Арнольд состоит в том, что посредством предложенного ею метода удается получать катализаторы для реакций, использующихся в фармацевтике и для синтеза искусственных материалов, которые либо не встречаются в природе (например, образование связи между атомом углерода и атомом кремния), либо должны осуществляться в аномальных условиях (в присутствии органических растворителей или химикатов, при высоких или низких температурах и т. д.). Но, кроме того, есть и фундаментальное значение: чем больше получают в лабораториях разных белков, химические и физические свойства которых впоследствии изучаются и сопоставляются, улучшая понимание физики биополимеров, тем выше становится предсказательная сила виртуальных моделей, предназначенных для целенаправленного дизайна нужных белков или для предсказания свойств пока неизученных природных белков.
Теперь поговорим о методе фагового дисплея. В первоначальной версии метод был разработан Джорджем Смитом в 1985 году. Метод основан на использованиибактериофага M13, который размножается в бактериях — кишечных палочках (E. coli). Фаг M13 хорош тем, что его капсид достаточно велик, чтобы вместить геном фага вместе со вставками, даже большими. Суть метода фагового дисплея состоит в том, что в геном бактериофага встраивается фрагмент, кодирующий какой-то интересующий нас пептид, либо целый белок, либо серия разнообразных фрагментов. В самом простом варианте это может быть набор совершенно случайных последовательностей. Встраивание производится в рамку считыванияодного из генов, которые кодируют белки капсида (всего у M13 таких белков пять). В результате такого встраивания фрагмента на поверхности фаговых частиц оказываются выставлены (в связке с собственными белками фага) закодированные в данном фрагменте пептиды. Фаги размножаются в бактериях — и по мере размножения естественным образом с некоторой частотой приобретают мутации. В итоге, после извлечения фаговых частиц из зараженных бактерий (миллиарды частиц за один раунд), получаем набор разнообразных версий исходно встроенного фрагмента и кодируемого этим фрагментом пептида. Все эти версии будут представлены на поверхности фагов — это и есть «фаговый дисплей». Так мы получаем первичную библиотеку фаговых частиц.
Фаговые частицы далее можно отобрать по способности связываться с нужными молекулами, а затем те частицы, которые прошли отбор, потому что связываются лучше других, можно снова использовать для заражения бактерий. Отбор проводится при помощи целлюлозных фильтров или магнитных бус, на которых закреплены нужные молекулы (получить представление о том, как происходит сбор нужных молекул на магнитные бусы можно, посмотрев небольшое видео). «Правильные» фаги останутся на носителе, а «неправильные» будут безжалостно смыты. Практика применения фагового дисплея показывает, что достаточно лишь пяти раундов, чтобы получить пептиды с очень высокой эффективностью связывания. Затем образцы ДНК, выделенной из фага, секвенируют, а на основе полученной селектированной последовательности исследователь может составлять генетические конструкции, которые дадут возможность получать необходимые белки в требуемых количествах в любом подходящем объекте — к примеру, в тех же кишечных палочках или дрожжах. Этот метод Грег Уинтер, другой лауреат премии, адаптировал для получения антител к определенным антигенам. Схема, которую он использовал, показана на рис. 6.
Рис. 5. Схема получения антител методом фагового дисплея
Рис. 6. Схема получения антител методом фагового дисплея. Рисунок из статьи C. J. Rossant et al., 2014. Phage display and hybridoma generation of antibodies to human CXCR2 yields antibodies with distinct mechanisms and epitopes
Существенным плюсом метода Уинтера является в первую очередь уход от необходимости использования иммунизированных животных для получения антител и гибридом (гибридов лимфоцитов и раковых клеток) для их массовой наработки. Фаговый дисплей — более быстрая, дешевая и гуманная методика. Кроме того, этот метод позволяет получать чисто человеческие антитела, что важно, если антитела используются в качестве лекарства — ведь антитела от животных, введенные в организм человека, сами по себе вызвали бы у человека сильный иммунный ответ.
Если требуется получить не только эффективное, но и специфичное связывание, то не составит труда включить в общую схему этап отбора против неселективно взаимодействующих частиц. В настоящее время фаговый дисплей используется отнюдь не только в небольших лабораториях, но и в массовом производстве лекарств и реактивов на основе антител (а информация о пептидах, связывающих разные антигены, собирается в общедоступную базу данных BDB). Вот лишь некоторые сферы их применения: обнаружение антигенов в исследуемых образцах (в частности, в целях диагностики), приготовление вакцин, противоопухолевые антитела, антитела для подавления аутоиммунных реакций, антитоксины, направленная доставка лекарств к больным тканям (включая раковые опухоли). В последнее десятилетие эту технологию научились применять и для более эффективной эволюции и отбора белков с ферментативной активностью.
В заключение следует сказать, что мы находимся отнюдь не в конце пути, а лишь в его начале (как обычно). Необходимость применения метода случайного поиска говорит нам о том, как мало мы еще знаем и насколько слабы наши предсказательные возможности. Но по мере того, как накапливаются знания, приобретенные методом проб и ошибок, мы все же двигаемся в сторону повышения разрешения картинки, по которой мы судим об окружающем мире.
Татьяна Романовская elementy.ru